Cálculo de la Sensibilidad Analítica para Técnicas por Unión Directa
       

(ej: IRMA, ELISA)

 

Método Convencional  

 

En el gráfico siguiente se representa la curva de calibración para los valores promedios obtenidos en la Tabla 13 (Errores de Calibración-Técnica  por Unión Directa).

 

patrones: uUI/ml

      NSB

0.15

0.5

   1.5

       4

    15

     30

     60

promedio:B cpm

      132

280

570

1514

3455

10514

18174

27866

 

 

Se representa B (cpm) = f (dosis)

 

 

 

 

La pendiente de la recta tangente a la curva B = f(dosis), para la dosis 4.0 uUI/ml, representada en el gráfico de color rosa, corresponde a la Sensibilidad en ese punto.

 

Esta pendiente responde al lím( Δ dosis → 0) de Δ B/ Δ dosis , o sea dB / d(dosis), donde

Δ dosis = dosis2 - dosis1

Δ B = (Respuesta para la dosis 2) – (Respuesta para la dosis 1)

dB/d (dosis): derivada primera de la función B = f(dosis)

 

Lo cual significa que la Sensibilidad Analítica en un punto puede calcularse como :

 

1-ΔB/Δdosis, tomando como recaudo que la Δdosis elegida sea despreciable comparada con la dosis (Δ dosis → 0).

Ejemplo para 4.0 uUI/ml, la pendiente de la recta tangente calculada a partir del gráfico es aprox. igual a  +800 cpm / (uUI/ml).

 

Para calcular este valor a partir de las ecuaciones, bastaría calcular el valor de cpm B(4.0  uUI/ml) y el valor  B (4.1 uUI/ml), es decir que Δdosis elegida es de 0.1 uUI/ml.

 

Para calcular las respuestas B (4.0 uUI/ml) y  B (4.1 uUI/ml), se puede aplicar la ec.de Rodbard, cálculo de los 4 parámetros.

 

B=((Bmáx-NSB)/(1+ ( [ C50 ] /[ P ] )m)+ NSB   EC.26 ECUACION  DE RODBARD para IRMA

 

C50 = 61.9  uUI/ml

NSB =139 cpm

Bmáx = 55002 cpm

m = 0.996

 

(Datos extraídos del programa Cembal 2.0.)

 

B (4.0 uUI/ml)   =  ( (55002-139) / (1+ ( [ 61.9 ] /[ 4.0] )0.996) + 139

 

B (4.1 uUI/ml)   =  ( (55002-139) /(1+ ( [ 61.9] /[ 4.1] )0.996) + 139

 

B (4.0 uUI/ml) =  3500 cpm

B (4.1 uUI/ml) =  3580 cpm

 

por lo tanto ΔB/ dosis = (3580-3500 cpm) / (4.1 uUI/ml-4.0 uUI/ml) = + 800 cpm/(uUI/ml)

 

En realidad este valor corresponde a la Sensibilidad media entre 4.0 y 4.1 uUI/ml.

Dado que la diferencia de 0.1 ng/ml puede considerarse como muy pequeña, podemos asignarle a este valor la sensibilidad del método para la dosis 4.0 uUI/ml

 

Sin embargo lo correcto es determinar d(B)/d(dosis), es decir calcular el valor de la derivada de la función en ese punto, esta función es la Sensibilidad Analítica del ensayo definido para cada punto.

 

d(B)/d(dosis)= + [(C50 m  m C (m-1) )/( C50 m + Cm)2 ](Bmáx.-N)         ec (31),

 

reemplazando por los valores correspondientes en el ejemplo se puede calcular d(B)/d(dosis) que nos indicará la Sensibilidad Analítica, en nuestro ejemplo en 4 uUI/ml.

 

[d(B)/d(dosis)]4.0 uUI/ml = [(61.9 0.996 0.996 · 4.0 (0.996-1)) / ( 61.9 0.996+4.0 0.996 )2 ](54863)

[d(B)/d(dosis)] 4.0 uUI/ml = +786 cpm / (uUI/ml)

 

La lectura indica: Cuanto varía la Respuesta del sistema cuando se produce un aumento en la dosis de 1 uUI/ml, a la concentración indicada. Obsérvese que esto no significa que si la dosis se aumenta de 4.0 a 5.0 uUI/ml la respuesta aumentaría en 786 cpm, por cuanto este valor es válido cuando la variación de la dosis tiende a cero.

Sólo es válido en las proximidades a 4.0  uUI/ml.

Es decir que si  B (4.0 uUI/ml) = 3500 cpm,

para B (4.1 uUI/ml) = B (4.0 uUI/ml) + [d(B)/d(dosis)] 4.0 uUI/ml · ∆dosis=

B (4.1  uUI/ml) = 3500 cpm + [+786 cpm / (uUI/ml)] · 0.1 uUI/ml = 3579 cpm

 

Si se repite el cálculo para todo el rango de medición se obtiene el siguiente gráfico, donde está representada la Sensibilidad Analítica en valor absoluto en función del logaritmo decimal de la concentración del analito (dosis). Recuérdese que en las técnicas por unión directa el signo positivo significa que la respuesta aumenta cuando aumenta la dosis.

 

 

 

 

Si se calculan los valores correspondientes a 1/SA, estaremos calculando la expresión [d(dosis)/d(B)], esta expresión indica en cuanto cambia la dosis, para lograr que B cambie en 1 cpm.

 

En la práctica esta expresión no tendría una aplicación inmediata, ya que debiéramos definir previamente una variación en cpm que sea estadísticamente significativa para cada una de las respuestas.

 

Sin embargo si está expresión se multiplica por (Bmáx-N) y se divide  por el valor de la dosis en estudio C, se arriba a la siguiente expresión:

 

[d(dosis) /d(B)] ·  [(Bmáx-N) / C]= [d(dosis)· (Bmáx-N)] / d(B) / C =

=[d(dosis)/C] / d(B)/(Bmáx-N) =

 

= d(dosis)/C / d(B/Bmáx), multiplicando numerador y denominador por 100.

 

= d(dosis)/C · 100/ d(B/Bmáx)· 100 =  %∆dosis / d(B/Bmáx%).

 

Esta expresión nos indica en que porcentaje tiene que cambiar la dosis en un punto para que la respuesta B/Bmáx % se modifique en una unidad. El taller denominó Inercia Relativa del Sistema (IR) a esta expresión: %∆dosis / 1 d(B/Bmáx%).

 

Para nuestro ejemplo:

 

SA(4.0 uUI/ml) =  +786 cpm / (uUI/ml)

 

 

 IR(4.0 uUI/ml)  = 1/SA · (Bmáx-N) / C =

 

= +[ (1/ 786)  uUI/ml / cpm · (55002-139) cpm ] / 4 uUI/ml = 17.4

 

 

Obsérvese que esta expresión no tiene unidades, de modo que puede expresarse al multiplicar y dividir por 100, como: Cuando la dosis varía 17.4 %, la respuesta B/Bmáx%,  se modifica en +1% .

 

El significado del signo positivo, se refiere que para una concentracion de 4 uUI/ml, un  aumento de 17.4 % de la dosis, produce un aumento de 1 en la respuesta B/Bmáx%.

 

En nuestro ejemplo.

 

%B/Bmáx (4.0 uUI/ml) = [(3500- 139 ) /(55002-139)] x 100 = 6.13%

 

17.4% de 4.0 uUI/ml = 0.69 uUI/ml

 

De acuerdo con ello, en 4.0 uUI/ml, para que el porcentaje B/Bmáx% varíe en + 1 unidad, es decir varíe a  7.13%, la dosis debe aumentar en 0.70 uUI/ml, o  sea  dosis = 4.70 uUI/ml.

 

Se puede calcular la Inercia Relativa del Sistema (IR) para cada valor de dosis, aplicando la siguiente ecuación:

 

IR = 1/SA * (Bmáx-N) / C =   + [( C50m + C m)2 ]  / m C50m  C m     ec (32)

 

En el  gráfico siguiente se representa para nuestro ejemplo la Inercia Relativa (IR) en función del log de la dosis.

 

 

 

El valor mínimo de la IR corresponde a  la dosis C50, es decir que el mínimo cambio relativo necesario para registrar un cambio en la respuesta se verifica en B/Bmáx. % = 50%.

 

Sin embargo en nuestro caso, este valor se encuentra fuera del rango de medición.

El valor máximo de este rango llega hasta 60 uUI/ml. Se ha graficado en línea roja la continuación de la curva de IR, para valores superiores con el propósito de observar el mínimo valor de IR.

Sin embargo debemos aclarar que esto es válido siempre y cuando se verifique la validez de los 4 parámetros determinados con las dosis ensayadas, para dosis superiores a 60 uUI/ml .

 

IV b-Cálculo de la Mínima Dosis Detectable para Técnica de Unión Directa

          Mét.Convencional Ej.IRMA

 

En el gráfico siguiente titulado Mínina Dosis Detectable se muestra la zona amplificada, correspondiente a bajas concentraciones de un gráfico de calibración  B (cpm) = f (dosis) para un ensayo  por Unión Directa (IRMA).

 

Los valores graficados corresponden a los promedios de los resultados experimentales para

 

patrones: uUI/ml

      NSB

0.15

0.5

   1.5

       4

    15

     30

     60

promedio:B cpm

      132

280

570

1514

3455

10514

18174

27866

 

 

 

La vista está reducida y ampliada hasta el rango de dosis indicado en el gráfico.

 

 

 

Si el CV % correspondiente a la determinación de la respuesta para concentración = 0 (NSB) fuera de  18 %  para n = 10,  ∆ será = 24 cpm.

 

Este valor corresponde a 1ds. y en el rango 132 ± 24 cpm se encontrarían el 68% de las respuestas individuales de NSB determinadas con una precisión del 18 %.

 

Sin embargo el valor de NSB, se determina como el promedio de dos replicados. Por lo tanto lo correcto es considerar la dispersión de los valores determinados por duplicados y no el de los valores individuales.

 

En ese caso para duplicados el CV % es igual al error standard del valor promedio determinado.

18 % / 2 0.5  = 18 % / 1.414 = 18 · 0.707 =  12.8%.

 

El desvío standard para duplicados cuyos valores individuales se determinaron con un CV % de 18 % es: 132 cpm · 0.0128 = 17 cpm

 

Por lo tanto el 68% de los valores determinados por duplicado se encontrarían en un rango igual a 132 ± 17 cpm.

 

La respuesta para NSB (determinada como el promedio de duplicados) que es poco probable que corresponda a NSB, puede considerarse a la correspondiente a  B = NSB medio + 2ds., es decir: 132 cpm + (2 · 17) cpm =  166  cpm .

 

Este valor máximo de respuesta para NSB, debe considerarse como el valor mínimo, determinado por duplicado, para  la Mínima Dosis Detectable (MDD).

 

Como esta dosis está próxima al valor = 0, asumiremos que las respuestas de esa dosis se realizan con la misma precisión que el 0, es decir 18 % para respuestas promedio, determinadas por duplicado, por lo tanto el rango de dispersión puede considerarse el mismo que para el 0.

 

BMDD ± 2 ds = BMDD ± (2 · 17) cpm = BMDD  ± 34 cpm.

 

Podemos considerar por lo tanto que : 166 cpm = BMDD  - 34 cpm  ; por lo tanto

BMDD  = 166 cpm +34 cpm= 200 cpm

 

200 cpm, es el valor de la respuesta promedio que corresponde a la MDD que al ser interpolado en el gráfico corresponde a una dosis de = 0.07  uUI/ml.

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